近年来肥胖症患者数量明显上升，造成肥胖的原因是体内脂肪过多堆积、脂质代谢异常。胰脂肪酶是人类脂质代谢的关键酶，可作为抗肥胖药物的特定靶点。食品来源的胰脂肪酶抑制剂，如多酚、多糖、多肽等不仅有效抑制胰脂肪酶的活性，而且安全性更高，是目前食品工业的研究热点。目前有报道沙棘籽粕蛋白可以有效降低糖尿病小鼠的体质量和体内甘油三酯的含量。活性肽是一类具有特殊生理功能的蛋白质片段，受到外界影响时，内部结构会发生变化，从而导致其性质发生改变。在前期研究的基础上，中国水产科学研究院南海水产研究所的相欢和华南理工大学食品科学与工程学院的崔春*首先探究了温度、pH值、金属离子、光照及氧气对沙棘籽粕蛋白胰脂肪酶肽抑制活性的影响。在此基础上，为获得具有更高活性的沙棘籽粕蛋白肽（SSPA），以猪胰脂肪酶（PPL）抑制率为指标，将沙棘籽粕蛋白酶解液依次通过超滤、大孔树脂进行分离，筛选出具有较强活性的多肽，利用分子对接分析活性肽与PPL之间的作用，化学合成活性肽对其活性进行评价，以期为产业化生产沙棘籽粕胰脂肪酶抑制肽提供理论基础。01SSPA稳定性分析如图1所示，外界环境会影响SSPA的PPL抑制活性。与常温条件下的SSPA相比，如图1A所示，适当升高温度（45、65 ℃）对SSPA的PPL抑制活性不会产生显著影响（P＜0.05），当温度升高到85 ℃，其PPL抑制活性显著降低，但仍保持在90%以上。SSPA对PPL抑制活性的保留率随pH值的变化呈现中间高两端低的特点，pH值过高或过低可能会对SSPA的结构造成影响从而影响其活性。但是整体而言，如图1B所示，在整个pH值范围内（3.0～12.0）PPL抑制活性保持在80%左右，表明SSPA具有较广的应用范围。如图1C所示，与未添加金属离子的SSPA相比，加入适量的Na ＋ 和Mg 2＋ 有助于提高SSPA的PPL抑制活性，而Ca 2＋ 的加入对于SSPA的PPL抑制活性无显著影响（P＞0.05），其余几种离子（Na ＋ 、Mn 2＋ 、Al 3＋ 、Cu 2＋ ）的加入使SSPA的PPL抑制活性有所降低，但影响不显著（P＞0.05）。而对于其他因素如光照和氧气对SSPA活性的影响如图1D所示，在日光灯和紫外灯照射条件下，SSPA的PPL抑制率无显著变化（P＞0.05），表明该产品在实际生产中可采用紫外灭菌。SSPA的PPL抑制活性在有氧和无氧条件下无显著差异，说明SSPA在短期贮藏的过程中不会因暴露于空气而影响其生物活性。02SSPA的分离纯化2.1 超滤分离SSPA如表2所示，SSPA及其超滤组分对PPL的IC50值不同，其中SSPA的IC50值最高（1 198 μg/mL），而经过超滤后其抑制效果明显增强，并且随着分子质量的降低呈现抑制增强的趋势，其中分子质量小于3 kDa的组分IC50为309.8 μg/mL，收集该组分并进行后续的分离鉴定。2.2 大孔树脂分离SSPAL2.2.1 不同种树脂对SSPAL吸附、解吸特性的影响4 种树脂对SSPAL吸附量和吸附率的影响如图2A、B所示，二者随着吸附时间的延长均显著增加，且最终达到吸附平衡（3～4 h），其中HPD826吸附效果最 佳，其次是XAD16、DA201C、D101。最终达到吸附平衡时，其吸附量分别为89.66（HPD826）、71.17（XAD16）、61.82（D101）、54.32 mg/g（DA201C），吸附率分别为60.31%（HPD826）、47.88%（XAD16）、41.58%（D101）、36.54%（DA201C）。如图2C所示，4 种树脂的解吸率显著不同，随着乙醇体积分数的增加，解吸率呈现 先增长后降低的趋势，且当乙醇体积分数为40%时，4 种树脂的解吸率较高，HPD826（98.36%）＞D101（95.58%）＞XAD16（87.09%）＞DA201C（79.16%），随着 乙醇体积分数增加到60%时，解吸率无显著变化，当乙醇体积分数增加到80%时，其解吸率明显下降，其原因可能是乙醇体积分数较高，导致蛋白质变性。因此最终选择体积分数40%乙醇溶液进行洗脱。以上结果表明这4 种树脂的吸附和解吸速率完全不同，需要采用动力学方程进一步计算并分析树脂的吸附动力学。如图2D所示，HPD826在0～4 min内快速扩散，之后从4～150 min缓慢吸附，最终在150～240 min内吸附饱和呈现平衡状态；其余3 种树脂同样保持3 个阶段的吸附，第1阶段为表面吸附（0～5 min），第2阶段为快速吸附扩散阶段（5～180 min），最后阶段为吸附缓慢最终饱和（180～240 min）。说明4 种树脂对SSPAL的吸附不同，且表现多重性质。2.2.2 SSPAL的HPD826树脂分离结果HPD826树脂在整个吸附过程中效果最佳。HPD826树脂具有相对理想的表面积（500～600 cm2），并且可以通过氢键与SSPAL中的侧链氨基酸相互作用，从而发挥更好的吸附和解吸能力。如表3所示，经HPD826大孔树脂分离之后，SSPAL的胰脂肪酶抑制率显著提高，IC50显著降低。03UPLC-MS/MS鉴定SSPA利用UPLC-MS/MS对SSPAL-E组分进行检测。如表4所示，一级质谱图中得到多个母离子，进行分析后得到二级离子碎片的信息。SSPA中鉴定得到31 种多 肽，其中含有2 个氨基酸的肽段有11 个，约占35.48%；含有3 个氨基酸的肽段有15 个。鉴定得到较多含精氨酸的多肽（19 个）。以Hippophae rhamnoides为关键词，在UniProt中进行搜索，发现大多数肽段来源于Protein TIC214，包括NN、VR、LR/IR、DR、TR、FD、EF、FR、PSP、ELR/EIR、EER和NLLHR。另外还有部分肽段来源于Protein Ycf2，包括EDS、QLF、FL(I)R和WRN。根据质谱数据（峰面积）计算得到分离组分中多肽总量为28.08%，其中VR、FR、RDR、APYR、NLLHR和EEAASLR的肽含量较高，分别为2.90%、7.40%、1.10%、1.50%、1.40%和1.10%。VR、FR和NLLHR均源于Protein TIC 214，RDR来源于Ribulose bisphosphatecarboxylase large chain，APYR来源于30S ribosomalprotein S2, chloroplastic，EEAASLR来源于PhotosystemI P700 chlorophylla apoprotein A2。使用Peptide Ranker可计算出多肽的生物活性潜力，SSPA的理论得分范围为0.036 7～0.997 1，说明其生物活性存在较大差异。据报道，预测得分超过0.5的多肽被认为具有较强的生理活性，表4中有20 个多肽得分大于0.5，可认为具有较高生物活性，根据ToxinPred分析，这20 种多肽均没有毒性，将对其进行后续分析。04SSPA的活性分析4.1 分子模拟分析SSPA的活性采用PepSite2对Peptide Ranker大于0.5的SSPA进行初步分析，继续筛选出P＜0.05的肽，分别是VR、FR、APYR、EEAASLR、RDR、NLLHR、QLF、ALPMDW、MLA和PSP。图3结合质谱图中强度评分最终筛选出多肽序列。除PSP和MLA外，其余8 个肽的强度均高于500，多肽强度变化为：EEAASLR（16 000）＞FR（8 000）＞NLLHR（5 000）＞APYR（2 000）=ALPMDW（2 000）＞RDR（1 600）＞QLF（1 000）＞VR（600）。分子对接结合能顺序为：EEAASLR=QLF＞FR=RDR＞VR＞APYR＞ALPMDW＞NLLHR，如表5所示，结合能越小说明抑制能力越强（）。结合以上分析结果及多肽含量，选择VR（2.90%）、FR（7.40%）、RDR（1.10%）、APYR（1.50%）、NLLHR（1.40%）和EEAASLR（1.10%）进行合成分析。4.2 SSPA与PPL结合位点分析分子对接结果表明多肽与 PPL 之间至少有一种相互 作用，这些相互作用（亲水作用、氢键、疏水作用、 π - π 相互作用 / 堆叠作用和范德华力）可以稳定肽 -PPL 复合物，并影响或改变 PPL 构象（图 4 ）。氢键是抑制 PPL 的主要因素，以上肽段均提供了 Arg （ R ）残基，精氨酸包含一个 α - 氨基、 α - 羧基和一个侧链胍基，因此能 够通过氢键与带电残基相互作用，并通过其亚甲基与 疏水残基相互作用。 VR 通过离子键（ Asp 80 ）、氢键（ Ser 153 、 Phe 78 ）、 π - π 共轭（ Phe 216 、 Tyr 115 ）和疏水相互作用（ Phe 216 、 Tyr 115 ）与 PPL 结合。 FR 主要通过氢键和 π - π 堆叠与 PPL 结合，其中氢键作用主要表现为 NH ： Phe 78 （ 2.58 Å ）、 Arg 257 （ 2.42 Å ）； OH ： Gly 77 （ 3.03 Å ）、 His 152 （ 2.62 Å ）。 π - π 堆叠主要表现为 Phe 的苯环与 PPL 中的 Tyr 115 、 Phe 216 和 Pro 181 残基的相互作用。 RDR 主要通过氢键与 PPL 结合， PPL 中的 His 152 、 Gly 77 和 Arg 257 与 RDR 中的氧原子结合，形成 OH 键。另外 PPL 中的 Phe 78 和 His 264 通过 CH 键与 RDR 结合。 PPL 中的 Phe 78 与 APYR 中的 R 基团上的 N 原子形成氢键，而 APYR 中的 Tyr 上的苯环与 PPL 中 Phe 216 和 Phe 78 中的苯环形成 π - π 相互作用。 NLLHR 与 PPL 的结合位点较多，主要表现为与 PPL 上的 Phe 78 （ 2.58 Å ）、 Arg 257 （ 2.42 Å ）、 His 152 （ 2.62 Å ）形成氢键，此外 NLLHR 与 PPL 上的 ALA 179 、 Pro 181 、 Phe 216 和 Ile 79 通过烷基或 π - 烷基作用结合。 EEAASLR 与 PPL 中的 Ar g 257 和 Phe 78 形成氢键，与 Phe216 形成 π - π 相互作用。4.3 SSPA活性验证如 表 6 所示， PPL 抑制效果最好的是 NLLHR（220.70 μg/mL），其次是FR（243.07 μg/mL）、RDR（250.50 μg/mL）、VR（371.07 μg/mL）、APYR（350.41 μg/mL）和EEAASLR（510.55 μg/mL）。Pearson相关性分析发现，分子对接结合能大小与SSPA胰脂肪酶抑制率强弱之间存在正相关（r =0.865，P＜0.05）。但是该结果与分离前相比，部分肽的活性反而低于分离前的混合物，表明混合物中可能含有其他影响PPL活性的物质。结合分子对接结果可知，FR、RDR和NLLHR与PPL之间具有更多的结合位点，发挥相应的功能活性。结论研究影响SSPA活性稳定性的因素，采用系列分离步骤逐步纯化SSPA，在此基础上采用UPLC-MS/MS鉴定活性肽的氨基酸序列，筛选高活性肽段，结合分子对接手段分析抑制作用位点，具体结果如下：SSPA具有热稳定性和pH值稳定性，适量Na ＋ 和Mg 2＋ 可显著提高SSPA的PPL抑制活性，SSPA在短期贮藏过程中不会因暴露于空气而影响PPL抑制活性。超滤分离结果表明分子质量小于3 kDa的组分PPL抑制效果最好；在4 种大孔树脂中，HPD826效果最佳，其吸附量、吸附率和解吸率分别可以达到89.66 mg/g、60.31%和98.36%。UPLC-MS/MS鉴定结合分子对接筛选得到6 个肽，IC50值分别为NLLHR（220.70 μg/mL）、FR（243.07 μg/mL）、RDR（250.50 μg/mL）、VR（371.07 μg/mL）、APYR（350.41 μg/mL）和EEAASLR（510.55 μg/mL）。以上6 个多肽通过氢键、π-π堆积与PPL结合。Pearson相关性分析表明，分子对接结合能高低与SSPA的PPL抑制率强弱之间存在正相关（R 2 =0.865，P＜0.05）。本文《沙棘籽粕蛋白肽的稳定性及分离纯化》来源于《食品科学》2023年44卷第18期49-57页，作者：相欢, 崔春。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20221201-003。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。实习编辑：美娟；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。